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- 2021-05-25 发布
[基础对点]
知识点一 蛋白质分离的原理和方法
1.分离不同种类的蛋白质依据的原理不包括( )
A．分子的形状和大小
B．所带电荷的性质和多少、吸附性质
C．对其他分子的亲和力
D．蛋白质分子的组成元素
答案 D
解析 分离不同种类的蛋白质依据的原理包括分子的形状和大小、所带电荷
的性质和多少、吸附性质、对其他分子的亲和力和蛋白质分子的溶解度等。蛋白
质分子的组成元素不是分离不同蛋白质的依据。
2．利用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是( )
A．蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小
B．蛋白质相对分子质量的大小
C．蛋白质所带电荷的多少
D．蛋白质溶解度的大小
答案 B
解析 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，相
对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对
分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此
相对分子质量不同的蛋白质得以分离。
3．下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中
的迁移速度
C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
答案 C
解析 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，在电场的作用下，
带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A 正确，C 错误；由于待分离样品
中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，会使带电分子产
生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，B 正确；琼脂糖凝胶电泳和
聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常见的电泳方法，D 正确。
4．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入 SDS 的作用是( )
A．增大蛋白质的相对分子质量
B．使蛋白质完全变性失活
C．掩盖不同种蛋白质间的电荷差别
D．减少蛋白质的相对分子质量
答案 C
解析 SDS 的作用是使蛋白质完全变性，SDS 所带负电荷量大大超过蛋白质
分子原有的电荷量，因而掩盖不同种类蛋白质间电荷差别。
知识点二 血红蛋白的提取和分离实验操作
5.分离血红蛋白时，将搅拌好的混合液转移到离心管中，以 2000 r/min 的速度
离心 10 min 后，可以明显看到试管中的溶液分为 4 层。下列描述中，正确的是( )
A．第 1 层为无色透明的甲苯层
B．第 2 层为红色透明层，含血红蛋白
C．第 4 层为白色薄层固体，是脂溶性沉淀物
D．第 3 层为暗红色沉淀物，含未破裂的细胞
答案 A
解析 第 1 层为无色透明的甲苯层；第 2 层为白色薄层固体，是脂溶性物质
的沉淀层；第 3 层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液；第 4 层是其他杂质的
暗红色沉淀物。
6．关于凝胶色谱柱的装填，除哪项外均为正确解释( )
A．交联葡聚糖凝胶(G－75)“G”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，
75 表示凝胶得水值
B．色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装
C．用 300 mL 物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶 12
h
D．凝胶用自来水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液
答案 D
解析 本实验中使用的交联葡聚糖凝胶(G－75)，其中 G 表示凝胶的交联程度、
膨胀程度及分离范围，75 表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水 7.5 g，A 正确；
气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，因此，一旦发现有气泡，
必须重装，B 正确；在凝胶色谱柱装填完之后，应在约 50 cm 高的操作压下，用
300 mL 物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶 12 小时，以使
凝胶装填紧密，C 正确；凝胶溶胀时，应使用蒸馏水将其充分溶胀，制成凝胶悬浮
液，D 错误。
7．下列对在凝胶色谱柱上加入样品和洗脱的操作的叙述，不正确的是( )
A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐
B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面
C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱
D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 5 mL 收集一
管，连续收集
答案 C
解析 待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，小心加入缓冲液到适当高
度，之后再连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
8．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是( )
A．防止血红蛋白被氧化
B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和
C．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D．让血红蛋白处在一定的 pH 范围内，维持其结构和功能
答案 D
解析 在血红蛋白的提取过程中，利用磷酸缓冲液模拟细胞内的 pH 环境，维
持血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和研究(活性)。
9．下列是有关血红蛋白的提取和分离的相关操作，其中正确的是( )
A．可采集猪血作为实验材料
B．用蒸馏水重复洗涤红细胞
C．血红蛋白释放后应低速短时间离心
D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
答案 A
解析 为防止红细胞吸水涨破，洗涤时要用生理盐水，B 错误；释放出血红蛋
白后，以 2000 r/min 的速度离心 10 min，C 错误；在分离时，要等到红色蛋白质接
近色谱柱底端时开始收集流出液，D 错误。
10．下列有关提取和分离猪血红蛋白的实验，叙述错误的是( )
A．用生理盐水洗涤红细胞，以防止红细胞破裂
B．用蒸馏水和甲苯处理红细胞，使其释放出血红蛋白
C．用生理盐水透析血红蛋白溶液，以保持血红蛋白活性
D．用磷酸缓冲液洗脱，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动
答案 C
解析 洗涤红细胞时要用生理盐水，以防止红细胞破裂，A 正确；在蒸馏水
和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白，B 正确；透析用的是磷酸缓冲液，
C 错误；洗脱用的是磷酸缓冲液，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动，D 正确。
[能力提升]
11．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的
性质和数量情况如图所示。下列叙述正确的是( )
A．将样品装入透析袋中透析 12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在
袋内
B．若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快
C．将样品以 2000 r/min 的速度离心 10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子
丙也存在于沉淀中
D．若五种物质为蛋白质，用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质
分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远
答案 C
解析 透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大
的物质不能透过，若分子乙保留在袋内，则分子甲不一定保留在袋内，A 错误；
用凝胶色谱柱分离蛋白质时，相对分子质量小的物质通过的路程长、移动慢，B
错误；离心时相对分子质量大的物质沉淀，若分子戊沉淀，则分子乙、丁、丙均
已沉淀，C 正确；用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率完全
取决于分子大小，故电泳带相距最远的是甲和丙，D 错误。
12．凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方
便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果，目前已经在生物化学、
分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用
于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
(1)a、b 均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是
_______________________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部 d 位置相当于多孔板的结构可由
________________替代。
(3) 装 填 凝 胶 色 谱 柱 时 ， 色 谱 柱 内 不 能 有 气 泡 存 在 ， 原 因 是
______________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体________(填“相同”或“不
同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________________________________。
答案 (1)a a 相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外
部移动，路程较短，移动速度较快
(2)尼龙网和尼龙纱
(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果
(4)相同 保持稳定
解析 用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然
后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能
分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙
中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，
从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩
散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。
在色谱柱制作时可用尼龙网和尼龙纱代替多孔板。在装填凝胶柱时，不得有气泡
存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗脱时要用
与浸泡凝胶的液体相同的液体，流速要稳定。
13．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中 O2 或
CO2 的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。
(1)将实验流程补充完整：A 为________________，B 为________________。
凝胶色谱法是根据__________________来分离蛋白质的有效方法。
(2)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤次数过少，无法完全除去；离心
速度过高和时间过长会使________一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标
志是______________________________。释放血红蛋白的过程中起作用的是
______________。
(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液(pH 为 7.0)的目
的 是 ____________________________________________ 。 如 果 红 色 区 带
______________，说明色谱柱制作成功。
答案 (1)血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱 相对分子质量的大小
(2)杂蛋白(或血浆蛋白) 白细胞 离心后的上清液不再呈现黄色 蒸馏水和
甲苯
(3)加速样品在凝胶柱中的流动 均匀一致地移动
解析 (1)样品处理及粗分离过程为：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离
血红蛋白溶液→透析，凝胶色谱操作过程为：凝胶色谱柱的制作→凝胶色谱柱的
装填→样品的加入和洗脱，所以 A 表示血红蛋白的释放，B 表示样品的加入和洗
脱，凝胶色谱法的原理是分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流
动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
(2)洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白，以利于后续步骤的分离纯化，洗涤次
数少，无法除去血浆蛋白，此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞一同沉
淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度，重复洗涤三次，直
至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净，由于甲苯是表面活性剂的一种，
可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，蒸馏水能使红细胞涨破。
(3)磷酸缓冲液(pH 为 7.0)能够模拟生物体内的生理环境，保持体外的 pH 和体
内的一致，洗脱时利用缓冲液，可以加快样品在凝胶柱中的流动，如果凝胶色谱
柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、
狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离
的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
14．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血
红蛋白的主要功能是携带 O2 和 CO2。我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的
血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。根据材料回答下列问题：
(1)实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进
行 破 碎 离 心 ， 收 集 血 红 蛋 白 溶 液 。 加 入 柠 檬 酸 钠 的 目 的 是
__________________________________________________________。
(2)在对样品进行处理时，主要包括______________、血红蛋白的释放；对样
品进行粗分离时主要包括：分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析技术的原
理是_______________________________。
(3)同学甲利用琼脂糖凝胶电泳技术，将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程
中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子的________、________以及分子
的形状等。而加入 SDS 后，使得蛋白质的迁移率只取决于____________。
(4)同学乙利用凝胶色谱法进行血红蛋白的分离(如图 1)，他在操作中加样的正
确顺序是________，在执行图 1 中②所示操作时，色谱柱下端连接的尼龙管应该
________(填“打开”或“关闭”)。
(5)图 2 是同学乙利用样品分离得到的结果，则图 2 中蛋白质分子量最小的是
________。
答案 (1)防止血液凝固
(2)红细胞的洗涤 小分子可以自由进出透析袋(半透膜)，而大分子不能通过
(3)大小 带电性质 分子的大小
(4)④①②③ 关闭
(5)丙
解析 (1)新鲜血液中加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。
(2)样品的处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放等步骤。分离血红蛋白所
用的透析方法的原理是半透膜的半透性，即小分子可以自由通过，大分子不能自
由通过。
(3)琼脂糖凝胶电泳时，影响蛋白质迁移速度的因素有蛋白质分子大小、带电
性质及分子的形状等。而加入 SDS 后，使蛋白质解聚成单链，SDS 可以与各种蛋
白质形成蛋白质—SDS 复合物，SDS 所带负电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷
量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使得蛋白质的迁移率只取决于分子
的大小。
(4)①为样品渗入凝胶床内的状态，②为样品完全进入凝胶层后加缓冲液到合
适高度；③为洗脱过程，④为装柱后平衡的操作，即正确顺序为④①②③；进行
②所示的环绕加缓冲液时，应关闭下端出口。
(5)由图 2 可看出，丙的洗脱时间最长，分子量应是最小的。